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近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，對各種代謝性疾病的基因定位和基因表達調(diào)控特征研究越來越多，通過PCR、基因芯片等技術(shù)方法進行遺傳代謝病的基因診斷已成為可能，也使該類疾病的診斷從傳統(tǒng)的表型診斷步入真正的病因診斷新階段。對遺傳代謝缺陷病進行及時篩查診斷并正確治療，是衡量一個國家醫(yī)學發(fā)展水平的重要指標。
(一)基因診斷的概念和特點
所謂基因診斷，就是利用現(xiàn)代生物學和分子遺傳學的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。基因診斷是繼形態(tài)學、生物化學和免疫學診斷之后的第四代診斷技術(shù)，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，更多先進、簡便的基因診斷方法也不斷涌現(xiàn)。
相對于傳統(tǒng)的表型診斷，基因診斷具有以下特點：①以基因作為檢查材料和探查目標，針對性強；②分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強；③分子雜交和PCR具有放大效應，故有較好的靈敏度；④適用性強，檢查目標可以為內(nèi)源基因，也可以為外源基因，診斷范圍廣。
(二)常用基因診斷技術(shù)
分子生物學技術(shù)很多，目前已有20種可以用于基因診斷。這些技術(shù)既包括一些傳統(tǒng)的突變分析技術(shù)，如單鏈構(gòu)象異構(gòu)多態(tài)分析技術(shù)、異質(zhì)性雙鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、錯配裂解法、變性液相色譜分析、等位基因特異性寡核苷酸雜交、等位基因特異性擴增等，也包括核酸分子雜交、：DNA測序、PCR擴增、基因芯片等許多新的技術(shù)方法及其聯(lián)合。
1．分子雜交技術(shù)具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的溫度和離子強度下，根據(jù)堿基互補的原則退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈。根據(jù)這一原理，可以用己知核酸片段作為探針并加以標記，用于檢測未知序列。分子雜交的過程是高度特異性的，可應用于基因克隆的篩選和酶切圖譜的制作、基因組中特定序列的定量和定性檢測、基因突變分析。根據(jù)檢測物質(zhì)的不同，分子雜交可以分為Southem雜交、Northem雜交、Dot雜交和Western雜交，分別用于檢測特定的DNA、RNA和蛋白質(zhì)。
2． PCR技術(shù) 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)又稱體外基因擴增技術(shù)，是通過引物和靶DNA的變性處理，在DNA聚合酶的作用下，以靶DNA為模板，合成引物之問的DNA片段，是一個由溫度控制反復進行熱變性、退火、引物延伸3個步驟而擴增DNA的循環(huán)過程。近些年來，PCR技術(shù)不斷發(fā)展，各種方法層出不窮，例如強化PCR、膜結(jié)合PCR、錨定PCR、錯配PCR、原位PCR、彩色PCR、反向PCR、不對稱PCR、增效PCR、定量PCR和重組PCR等。而PCR與限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLPs)、特異性寡核苷酸探針斑點雜交(ASO)、單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、異源雙鏈分析法(HA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等其他技術(shù)相結(jié)合形成的新方法，使PCR技術(shù)的實用性得到了延伸、補充和發(fā)展。
3．DNA測序技術(shù) DNA測序技術(shù)是人類探知大自然和生命奧秘的重要武器，也是遺傳代謝病基因診斷的基本方法，具有穩(wěn)定、簡便、重復性好、自動化程度高等優(yōu)點。Sanger雙脫氧鏈中止法是zui常用的測序方法，其基本原理是用放射性同位素標記引物，用雙脫氧核苷酸終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長度不等的DNA片段，再由高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影讀取結(jié)果。在各種篩選方法的敏感性和特異性受*，DNA測序無疑是突變分析zui重要的方法。現(xiàn)在的直接測序方法用四色熒光標記代替了放射性同位素標記。目前型的全自動遺傳分析儀自動化程度高、通量大，檢出率可達到1000/0，可重復性達到100%。對于短序列的片段分析，也可采用焦磷酸測序技術(shù)。
4．熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是用生物素或地高辛等非放射性物質(zhì)標記探針，根據(jù)堿基配對原則進行雜交，并通過熒光素偶聯(lián)的抗原-抗體檢測系統(tǒng)，在組織、細胞及染色體上對DNA或RNA進行定性及定位分析的一種技術(shù)。FISH技術(shù)經(jīng)不斷改革和完善，己衍生為一系列包括染色體涂染、間期熒光原位雜交、多色熒光原位雜交和DNA纖維熒光原位雜交等FISH技術(shù)，在基因制圖、染色體進化、先天畸形診斷、腫瘤診斷和產(chǎn)前診斷等方面都得到了廣泛的應用。
5．基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是建立在雜交測序理論基礎(chǔ)上的一種全新技術(shù)，是將許多特定的基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后通過與待測的標記樣品按堿基配對原理進行雜交，再通過檢測系統(tǒng)對其進行掃描，并用相應的軟件對信號進行比較和檢測，得到所需的大量信息，進行基因高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。
基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)使基因序列測定、基因功能測定等工作的程序得到了極大的簡化。該項技術(shù)已經(jīng)在基因多態(tài)性分析、基因表達分析等多方面得到了廣泛的應用，并已應用于臨床診斷。例如，一種可檢測已知突變的芯片，可同時檢測117種常見的LDL-R基因點突變和Apo B100基因在3500位點的突變，1180個經(jīng)：DNA測序證實存在突變的家族性高膽固醇血癥(FH)患者采用該芯片檢測全部得到相同結(jié)果，特異性和敏感性分別達99.7%和99.9%。
6．多重連接探針擴增技術(shù) 多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex 1igation-dependentprobeamplification，MLPA)是利用核酸雜交、連接反應和PCR擴增反應，可以在同一試管內(nèi)檢測多達45個不同核酸序列拷貝數(shù)變化，已廣泛應用于染色體異常、基因點突變、基因缺失突變等研究領(lǐng)域。其優(yōu)點為靈敏度高、專一性強、相對簡單、成本低、高處理速度等。多重連接探針擴增技術(shù)可檢測出基于外顯子測序分析方法檢測不到的基因突變，有可能成為一種新的遺傳代謝病分子診斷工具。
(三)遺傳代謝病的基因診斷策略
基因診斷可分為直接診斷和間接診斷。直接診斷是以基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產(chǎn)物，以探查基因本身有無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，它適用于已知基因異常的疾病。而當致病基因未知或致病基因異常未知時，可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體，這稱為間接基因診斷。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位點，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點作為標記。
1．基因診斷方法的選擇各種遺傳病的基因異常不同，要根據(jù)致病基因的變化方式選擇相應的基因診斷方法。
遺傳代謝病的基因異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。后者包括單個堿基置換、微小缺失或插入。近年來不斷發(fā)現(xiàn)一些遺傳病是由于基因內(nèi)的三核苷酸重復順序增加引起的，根據(jù)對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴增直接檢測；點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢測。一般無需對家系成員進行分析。但條件是必須知道基因異常的性質(zhì)，并肯定該異常與疾病之間的關(guān)系。然而，由于許多疾病的遺傳異質(zhì)性，以及多數(shù)遺傳基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。
許多遺傳病的基因尚未分離克隆，或基因異常尚不清楚，因此還不能根據(jù)突變的性質(zhì)進行診斷。但如果通過家系分析能證明某一DNA標記與致病基因連鎖，則凡帶有該標記的成員都可能帶有致病基因，從而可作出間接的連鎖分析診斷。
2．基因診斷策略的確定
(1)基因缺失型遺傳代謝病的診斷：可以采用核酸雜交、基因測序、基因芯片、PCR/RFLP等多種方法進行。例如，a-地中海貧血主要是由于血紅蛋白a基因缺失引起的一種遺傳代謝病。正?；蚪M用BamHI切割，可以得到一個14kb的片段，而缺失一個a基因時切點向5’端移位，得到一條10kb的片段。因此，當用a基因探針與基因組DNA進行Southern雜交時，正常人可見一條雙份的14kb的帶，在a-地中海貧血患者則可見一條14kb和一條10kb的帶，或者一條單拷貝的14kb的帶，血紅蛋白H病時只有一條10kb的帶，而在。Bats水腫胎時，則無任何雜交帶。
(2)點突變型遺傳病的基因診斷：常用PCR、RFLP和ASO探針等進行。例如，鐮形細胞性貧血已知突變基因是編碼β-珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG，從而使纈氨酸取代了甘氨酸，因此，可用RFLP進行基因診斷。已知限制酶MstⅡ切割的識別順序是CCTNAGG，它能切割正常β鏈中的CCTGAGG序列，但不能切割突變了的CCTGTGG(A→T)。這樣，由于突變消除了一個切點，使內(nèi)切酶長度片段發(fā)生了改變，通過電泳，就可以區(qū)別正常的βA和βS。由于突變部位和性質(zhì)已*明了，也可以合成寡核苷酸探針，用32P標記后用ASO探針進行診斷。
(3)基因異常不明的遺傳病的診斷：這類遺傳代謝病大多通過連鎖分析進行間接診斷。
例如，成年型多囊染色體顯性遺傳病，發(fā)病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫，臨床表現(xiàn)為腰痛、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結(jié)石等，zui終可導致腎功能衰竭和尿毒癥。本病基因定位于16p13，與a-珠蛋白基因3’端相鄰，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機制也尚未闡明。因此，只能用連鎖分析進行基因的發(fā)病前診斷和產(chǎn)前診斷。
隨著基因組學和蛋白質(zhì)組學的飛速發(fā)展，遺傳代謝病的病因?qū)W研究和基因診斷也越來越深入。分子診斷學在該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向是發(fā)揮其在疾病預測、預防和個體化治療中的作用，充分發(fā)揮分子診斷在克服耐藥性治療中所起到的不可替代的作用，同時必須關(guān)注分子診斷中的醫(yī)學倫理和生物安全問題，并加強基因診斷技術(shù)的質(zhì)量控制。
參考資料：骨代謝異常的生物化學檢驗
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